1、前言
SOD是一种重要的氧自由基的主要清除剂,具有很强的抗氧化能力。自由基是需氧生物生命活动过程中多种生化反应的中间代谢产物,是机体有效的防御系统,但当其产生过多或清除过慢时,便会通过攻击生命大分子物质及各种细胞器官而造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤,SOD作为一种生物活性成分广泛应用于保健食品、化妆品和牙膏等日化产品中。目前所用SOD产品均为从人血或动物血液中提取,但随着国际上疯牛病、口啼疫等传染性疾病的蔓延,动物血液中提取的SOD的使用给人们带来了不少的危险因素。从植物,特别是人们日常食用的无污染蔬菜、瓜果、野生植物及粮食中提取SOD,如大蒜、沙棘果、刺梨、余甘子、五味子、花粉、小白菜及其它果蔬以及绿豆、玉米等粮食中含有丰富的SOD,资源丰富,使用安全性非常高,避免了可能发生的交叉感染,且成本低廉。
2、超氧化物歧化酶的制备工艺
超氧化物歧化酶的制备工艺是依据酶蛋白质的性质而设计的,其方法也是常用的蛋白质分离方法,如热变性法、等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、超滤法、层析法等,或者几种方法的结合作用。
(一)沉淀法制备超氧化物歧化酶
1、原理
SOD是一种热稳定性较好的酶,当温度低于80℃,短时间的热处理酶活力损失不大,而一般杂蛋白却在高于55℃易变性沉淀。也可根据酶蛋白在等电点时,溶液中的静电荷为零,酶蛋白的溶解度最小而沉淀下来。或者在超氧化物歧化酶粗酶溶液中加入一些弱极性有机溶剂如丙酮,改变了溶液的介电常数,可使不同种类的蛋白质的溶解度产生不同程度的下降。因此,利用上述方法可以把超氧化物歧化酶和其他杂蛋白分开。
2、化学试剂
邻苯三酚、磷酸氢二钾、硫酸铜、酒石酸钾钠、丙酮、标准蛋白(牛血清蛋白)。
3、设备
恒温水浴锅、PH数字酸度计、调整冷冻离心机、冰箱、透析袋、冷冻干燥机等。
4、工艺流程
不同原料,其工艺步骤和条件有所不同,基本流程如下:
5、工艺说明(以大蒜SOD的制备工艺为例)
(1)粗酶液制备:将大蒜与PH7.8磷酸钾缓冲液按质量、体积比为1∶1.5添加,组织捣碎,在4℃的环境中浸提3h,四层纱布过滤,得粗酶液。
(2)热变性:把粗酶液用60℃、20min进行热变性,然后进行4℃、r/min离心。
(3)等电点沉淀:用磷酸调整溶液PH至3.5,然后4℃、r/min离心。
(4)丙酮沉淀加入丙酮的量为1.0%(体积分数),4℃、r/min离心,去除大部分杂蛋白,在所得上清液中加入1.2%～1.4%体积分数的丙酮使SOD全部沉淀下来。
(5)透析:将沉淀溶解在少量的缓冲液中,在4℃环境中透析10h。
(6)冷冻干燥:将透析过的样品进行冷冻干燥,即得成品。
(二)盐析法和金属螯合亲和层析法制备超氧化物歧化酶
1、原理
当溶液中盐浓度增高到一定数值时,使水活度降低,导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和,水化膜逐渐被破坏,最终引起蛋白分子间相互聚集并从溶液中析出。选择一定浓度范围的盐浓度(如1%～25%饱和度硫酸铵),使部分杂质呈“盐析”(沉淀)状态,有效成分呈“盐溶”状态。经离心分离后得到上清液,再选择一定浓度范围的盐溶液(如25%～60%饱和度的盐溶液),使SOD呈盐析状态。而另一部分杂质呈盐溶状态,用离心法收集的沉淀即为初步分离制备的SOD。
亲和层析法是把对SOD具有识别能力的配体Cu2+以共价键的方式固化到含有活化基团基质如壳聚糖上,然后装入层析柱,欲分离的SOD粗酶液通过该柱时,由于静电引力、结构互补效应等作用使其被吸附,而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来。然后,适宜地改变起始缓冲液的PH,或增加离子强度,或加入抑制剂等,即可把SOD解离下来。显然,通过这一操作程序可把SOD和杂蛋白分开。
2、化学试剂
壳聚糖螯合吸附剂、硫酸铜等。
3、设备
自动平衡记录仪、高速冷冻离心机、层析柱。
4、工艺流程
5、工艺说明(以大蒜SOD的制备工艺为例)(1)粗酶液制备:将大蒜与PH7.8磷酸钾缓冲液按重量体积比为1∶1.5添加,组织捣碎,在4℃环境中浸提3h,四层纱布过滤,即得粗酶液。(2)盐析:粗酶液加硫酸铵至55%饱和度,4℃环境中静置过夜,r/min离心20min,取上清液加硫酸铵固体粉末至95%的饱和度,静置3h后离心20min,取沉淀备用。(3)亲和层术柱的制备:取以壳聚糖为基质合成的螯合吸附剂装柱,用浓度为0.1mol/LCuSO4灌柱至饱和。螯合柱用PH7.8含0.5mol/LNaCL的0.05mol/L的磷酸纳缓冲液进行平衡后备用。(4)亲合层析:取样品上柱,以含0.5mol/LNa-CL和0.05mol/L磷酸钠缓冲液进行洗脱,控制流速为1.0mL/min。每3min为一管,并以核酸蛋白检测仪进行监测,收集活性部分。(5)透析和冷冻干燥:将活性部分在4℃环境中透析12～25h,冷冻干燥即得成品。
三、超氧化物歧化酶的修饰工艺
为了提高超氧化物歧化酶的稳定性,应对超氧化物歧化酶分子进行必要的修饰改造。目前对SOD分子进行分子修饰改造的途径有:①对SOD氨基酸残基进行化学修饰;②用水溶性大分子对SOD氨基酸进行共价修饰;③对SOD进行酶切修饰。常用的修饰剂有硬脂酸、月桂酸、聚乙二醇、葡萄糖酸内酯、右旋糖酐等。修饰酶不仅完全保留了天然酶的活性,较天然酶稳定,而且在耐热、耐酸、耐碱和抗胃蛋白酶水解能力等方面明显优于天然酶。
(一)硬脂酸修饰法
1、原理
将硬脂酸活化成硬脂酰氯,在一定条件下对SOD分子中的刺氨酸ε—氨基进行修饰,提高了其稳定性。
2、化学试剂
硬脂酸、丙酮、磷酸钾缓冲液等。
3、设备
减压蒸馏装置、高速冷冻离心机、冷冻干燥机等
4、工艺流程
(二)糖酯修饰法
1、原理
在一定条件下,将葡萄糖酸内酯与超氧化物歧化酶上赖氨酸的ε—氨基结合,提高其稳定性。
2、化学试剂
葡萄糖酸内酯、丙酮、十二醇、对甲苯磺酸、甲苯、氯仿、磷酸盐缓冲液、碳酸钠、三乙胺等。
3、设备
减压蒸馏装置、调整冷冻离心机、冷冻干燥机等。
4、工艺流程
(三)聚乙二醇修饰法
1、原理
在一定条件下,经活化的聚乙二醇对SOD非活性部位上赖氨酸的ε—氨基进行修饰,增强了SOD对环境的稳定性。
2、化学试剂
聚乙二醇、三聚氰氯、四硼酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等。
3、设备
真空干燥器、冷冻干燥机等。
4、工艺流程
3、超氧化物歧化酶的应用
(一)在药用方面
在美国、德国、日本、加拿大、澳大利亚、法国等先进工业国家,SOD应用广泛。目前临床应用上主要用于清除炎症、抗病毒及增强免疫力等,特别是用于内风湿、关节炎及放射性治疗后引起的皮肤炎症,SOD在防止癌细胞扩散和作为抗衰老的药物已引起医药界人士的极大兴趣,如即将获得二类新药证书的国产注射用SOD注射液的临床应用(包括抗炎、抗辐射损伤和抗缺血再灌损伤)。
(二)在食品工业上的应用
目前,SOD及化学修饰SOD在食品工业中的应用日益广泛,远远超过了相应的理论研究水平。SOD在食品工业中的应用可概括如下几个方面。
1、作为保健食品的功效因子或食品营养强化剂现已证实,目前已有添加有SOD的蛋黄酱、牛奶、可溶性咖啡、啤酒、白酒、果汁饮料、矿泉水、奶糖、酸牛乳、冷饮等类型的保健食品面市。
2、各种剂型的SOD或复合型食品
现已有胶囊、片剂、口服液、脂质体、颗粒剂等形式的SOD保健食品问世。
3、用作抗氧剂
与其它抗氧剂一样,SOD可作为罐头食品、果汁、啤酒等抗氧剂、防止过氧化酶引起的食品变质及腐败现象。此外,还可作为水果、蔬菜良好的保鲜剂。
4、加工成保健食品
以富含SOD原料未经提取,直接修饰加工制成保健食品,如大蒜饮料、刺梨汁、余甘子粉(汁)等,这也是一种新的发展趋势。
(三)在日化方面的应用
1、SOD具有很强的渗透至细胞内的能力,作为化妆品的添加剂后,可美容减皱、抗老年斑形成、使色斑淡化、对皮肤瘙痒、痤疮、日光性皮炎等有治疗作用,若用其与维生素类物质和过氧化物酶配合使用,效果更佳。
2、SOD添加剂制成的牙膏,不仅有健齿能力,还具有很好防龋、脱敏和消炎的作用。
4、展望
由于高龄化社会的到来,世界各国都以巨大的热情研制延缓衰老的食品及保健品。总的来说,衰老过程在体内逐步进行,机体内各器官在形态结构和功能方面发生一系列变化。目前老年人口还存在有增长趋势。为一种有益的活性成份,SOD已成为多种保健食品、化妆品和牙膏等日化产品的功效因子或添加剂,,具有十分重要的经济意义和社会价值.
